2º Fichamento

Método rápido de extração de DNA de bactérias

ROSA, Daniel Dias. Summa phytopathol. vol.34 no.3 Botucatu July/Sept. 2008. Universidade Estadual Paulista UNESP, Faculdade de Ciências Agronômicas - FCA, Departamento de Produção Vegetal - Setor de Defesa Fitossanitária, CP 237, CEP: 18603-970 Botucatu, SP. Bolsista do CNPq - Brasil

A parede celular das células procarióticas sempre foi uma grande vantagem para esses organismos, pois ela apresenta diversas características como elasticidade, resistência a pressão, a altas temperaturas e a valores extremos de pH. A coloração diferencial de Gram divide as bactérias em dois grupos: Gram-positivas e Gram-negativas, sendo o grupo das Gram negativas em maior número para a fitopatologia. A reação das bactérias à técnica de Gram é relacionada diretamente à composição química, estrutural e a permeabilidade da parede celular.A parede celular das bactérias Gram-positivas é constituída de uma camada espessa composta por peptídioglicano, responsável pela sua rigidez, já nas gram-negativas, a camada de peptidioglicano é mais fina, relativamente, que consequentemente confere uma maior fragilidade.
Essa característica faz com que a quebra da parede celular nas gram-positivas apresente maior dificuldade, que acaba por acarretar que as técnicas utilizadas para a quebra desta parede sejam muitas vezes trabalhosas,tornado as técnicas mais custosa e demoradas.
Atualmente existe a grande necessidade de se obter técnicas baratas, rápidas e eficientes para obtenção de DNA.Este trabalho teve por objetivo avaliar um método de extração de DNA pela quebra da parede celular, utilizando-se da ação mecânica, causada por carbonato de silício.
Culturas bacterianas foram desenvolvidas em tubos do tipo Falcon, contendo 10 mL de meio de cultura Nutriente Líquido por 24 horas, a 28ºC, sobre agitação constante a 110 rpm. Após este período, as culturas foram centrifugadas a 5000 g por 30 minutos, descartando-se o sobrenadante e obtendo-se um precipitado, o qual foi ressuspendido em 1 mL de tampão de extração. O volume obtido foi transferido para um microtubo de 1,7 mL, no qual foi acrescido de 0,2 gramas de carbonato de silício. Uma massa de 10 gramas de carbonato de silício foi previamente tratada com uma solução de 50 mL de ácido clorídrico 10M, por 2 horas a temperatura de 30ºC, seguida de lavagem continua por 12 horas com água destilada, e posteriormente foi autoclavado a 120ºC por 20 minutos e seco em estufa a 70ºC por 24 horas. O microtubo contendo tampão de extração mais células bacterianas e o carbonato de silício foi agitado em aparelho tipo "vortex" a 2000 rpm por 2 minutos, para romper a parede celular.
Para verificar a degradação dos DNA extraído efetuou-se uma análise utilizando-se de gel de agarose 1% em eletroforese de campo pulsado, com 6 Volts/cm, ciclos de 25 por 35, por 12 horas de corrida e visualizado em um aparelho transluminador com luz UV.
Na análise do DNA por espectrofotometria mostrou uma boa qualidade deste. Baseado nos valores da razão da absorbância de 260nm/280nm mostrou que o DNA obtido estava de boa qualidade e com baixas concentrações de proteínas e de RNA. A análise da extração do DNA em gel de agarose mostrou que a quantidade de quebra de DNA foi pequena, obtendo-se uma banda bem visível com pouco sinal de degradação e com boa quantidade extraída quando efetuada a análise quantitativa do DNA em relação ao marcador.
Para comprovar a possibilidade da utilização do DNA extraído, por este método, para técnicas mais refinadas, como clonagem de grandes fragmentos de DNA em vetores do tipo BAC (Bacterial Artificial Chromosomal), efetuou-se a análise dos DNAs extraídos em eletroforese de campo pulsado por 11 horas, que mostrou uma fragmentação do DNA aceitável, apresentando fragmentos que variaram de 48.500 pares de base a 291.000 pares de base, mostrando assim que é viável a utilização desta técnica para construção de BACs (Dados não apresentados).